Estudio de eficacia del Eugenol ante una infección experimental de Salmonella Enteritidis en gallinas ponedoras en producción

01/07/2014

Aditivos Salmonella

Aditivos Salmonella

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Lidervet

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Por G. Ordóñez,  CESAC – Centre de Sanitat Avícola de Catalunya i Aragó  (Reus, España) -,  y  N. Llopis y P. Peñalver, Lidervet S. L.(Tarragona, España)

 

Summary

Para establecer la eficacia del aceite esencial de Eugenia caryophyllata contra Salmonella entérica serotipo Enteritidis se realizó un estudio experimental con pollitas ISA Brown de 15 semanas de edad.

En esta  prueba se establecieron 4 grupos, alimentando las pollitas de los grupos 3 y 4 con un pienso compuesto comercial, mientras que las pollitas de los grupos 1 y 2 fueron alimentadas con el mismo pienso más el producto aromático a dosis de 250 g/Tm.

A las 19 semanas de edad, las pollitas de los grupos 1 y 3 fueron infectadas individualmente con un inóculo de 3,2±0,8×107 UFC de Salmonella enterica serovar Enteritidis/pollita. Durante el período post-inoculación, se recogieron muestras de heces y huevos, y las pollitas fueron sacrificadas 30 días después de la inoculación.

El producto aromático conteniendo eugenol ayuda en la limpieza de las infecciones intestinales y sistémicas, y también juega un papel importante en el control de la contaminación cruzada de Salmonella en huevos.

 

Introducción

Durante años, las enfermedades transmitidas por el consumo de alimentos contaminados con bacterias patógenas, sus toxinas, o ambas, han sido de vital importancia para la salud pública.

Las plantas aromáticas se han utilizado desde la antigüedad por sus propiedades medicinales y conservantes, así como para aportar aroma y sabor a los alimentos. Todas estas propiedades son atribuibles a los aceites esenciales que contienen.

Los agentes antimicrobianos, como los conservantes, ácidos orgánicos y especias, se han utilizado para inhibir las bacterias transmitidas por los alimentos y alargar la vida útil de los alimentos procesados. Muchos compuestos naturales que se encuentran en los vegetales, plantas medicinales y especias han demostrado poseer funciones antimicrobianas e inmunoestimulantes, y se podrían utilizar como fuente de agentes antimicrobianos contra patógenos alimentarios. Los compuestos fenólicos de los aceites esenciales poseen una alta actividad antimicrobiana in vitro frente a los patógenos alimentarios.

 Los antibióticos promotores de crecimiento (AGP, siglas en inglés) han sido utilizados para el control de patógenos tales como Escherichia coli o Clostridium perfringens (que puede tener una influencia sobre la digestibilidad), o Salmonella (que, además, es también responsable de zoonosis). Los prebióticos, probióticos o los mecanismos de exclusión competitiva han sido considerados como una forma de controlar la microflora del tracto digestivo al hacer más difícil la proliferación de patógenos y favorecer el crecimiento de microorganismos beneficiosos, tales como los Lactobacillus .

Recientemente, las restricciones sobre el uso de antibióticos como promotores de crecimiento animal, han alentado el uso de los aceites esenciales como alternativas a los AGP. Las propiedades metabólicas de los aceites esenciales han demostrado que pueden aumentar la digestibilidad y la absorción de nutrientes en un 5% y aumentar el peso de las camadas hasta en un 18% .

En nuestros estudios de campo utilizando un producto aromático compuesto por aceite esencial de clavo de origen natural, como alternativa natural a los AGP, éste ha demostrado una sorprendente capacidad para controlar la Salmonella en huevos.Esta evidencia llevó a realizar un estudio para observar la actividad del aceite esencial de clavo en una infección controlada con Salmonella entérica serovar Enteritidis en una granja experimental, basándose en los estudios de Humphrey y col., Aabo y col., Berchieri y col., Nakamura y col., y Wigley y col.

 

Materiales y Métodos

1 . Diseño experimental

En el ensayo se utilizaron 100 pollitas ponedoras comerciales ISA Brown de 15 semanas de edad, de un lote que había obtenido resultados negativos para Salmonella en heces 2 semanas antes de trasladarlas a la granja experimental del Centre de Sanitat Avícola de Catalunya i Aragó en Reus (Tarragona).

 Las pollitas fueron vacunadas siguiendo el programa estándar para gallinas ponedoras comerciales (excluyendo la vacuna contra Salmonella spp.).

A su llegada a la granja experimental, las pollitas se mantuvieron en periodo de observación y aclimatación de 9 días. Pasado este período, se distribuyeron en 4 grupos. Las pollitas de los grupos 1 y 2 fueron alimentadas durante todo el estudio con un alimento comercial con el producto aromático que contenía eugenol  a la dosis de 250 ppm. Las pollitas de los grupos 3 y 4 fueren alimentadas con el mismo pienso sin el producto aromático. Ninguna de las gallinas recibió otra medicación que la de su tratamiento.

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Las pollitas se distribuyeron en jaulas identificadas con códigos numéricos específicos. Siguiendo la Directiva 86/609/CEE y en aplicación del Decret 214/1997/DOGC sobre la regulación de animales destinados a la experimentación científica, los animales se mantuvieron en un espacio mínimo de 550 cm2/animal.

Después de 3 semanas en la granja experimental y consumiendo el alimento suministrado con el producto aromático conteniendo eugenol, los animales del grupo 1 (tratado con aceite esencial) y el grupo 3 (control positivo) fueron inoculados con Salmonella Enteritidis. La inoculación se llevó a cabo individualmente a dosis única de 1 ml, y directamente al buche, mediante una jeringa que contenía aproximadamente 3,2×107 ufc de Salmonella Enteritidis. Los animales de los grupos 2 (tratados con aceite esencial) y 4 (control negativo) no se inocularon.

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Tabla 1. Descripción detallada del diseño experimental de la prueba

En el periodo post-inoculación se tomaron muestras de heces y huevos. Las gallinas fueron sacrificadas a los 30 días post-inoculación. Durante la prueba, se suministró agua y pienso ad libitum. El agua potable provenía directamente de la red general. Se estableció un programa de iluminación de 24 h. El estado sanitario del pienso fue controlado y certificado previamente por el proveedor de piensos para asegurar la ausencia de Salmonella spp. Además, el peso, consumo de pienso, y la tasa de puesta de la gallina fueron monitorizados durante la prueba.

 

2. Preparado aromático

lidervet-imagenEl producto aromático  contiene aceite esencial natural de Eugenia caryophyllata o Syzygium aromaticum, en un excipiente inerte de dióxido de sílice amorfo, y con una eficaz protección frente a la granulación.

La concentración de eugenol en el producto aromático era de un 20%. La valoración química de los componentes del aceite se realizó mediante Gas Chromatography / Quadrupole Mass Spectroscopy (Hewlet Packard 5973). A través de esta valoración, se observó que su perfil correspondía al descrito en las clasificaciones botánicas para Eugenia caryophyllata.

 

 3. Cultivo de Salmonella

 

La Salmonella Enteritidis fue aislada según norma ISO 6579:2002, basado en el método de Rappaport-Vassiliadis para seleccionar Salmonella spp. frente a otras bacterias en muestras de polvo y heces.

La detección de Salmonella requiere 4 etapas sucesivas:

  • Preenriquecimiento en medio líquido no selectivo (agua de peptona tamponada a 37 ± 1°C durante 18 h ± 2 h.)
  • Enriquecimiento en medio selectivo semisólido (placas de agar Rappaport-Vassiliadis semisólido modificado incubadas a 41.5 ± 1°C durante 24 h ± 3 h.; si una placa es negativa después de 24 h, se incuba durante otras 24 ± 3 h.)
  • Placas e identificación selectivas (2 medios sólidos selectivos se inoculan: agar xilosa-lisina-desoxicolato y Difco Brilliant Green agar, incubadas a 37 ± 1°C y examinadas después de 24 ± 3 h).
  • Y confirmación de la identidad por medio del Triple Sugar Iron y el sistema BBL Crystal Identification System Kit. Posteriormente, se realiza un ensayo de microcolección de anticuerpos desarrollados para la serotipificación de Salmonella basados en el esquema de Kauffmann-White. El suero fue analizado para detectar anticuerpos contra la Salmonella utilizando un kit comercial ELISA.

 

4. Preparación del inóculo

El inóculo fue preparado en el CESAC a partir de una cepa de Salmonella serovar Enteritidis aislada de un lote de aves infectadas de forma natural.

La cepa mantenida en cultivo puro, se reactivó mediante crecimiento en Medio líquido Caldo Nutritivo (Oxoid, CM67) incubado a 37ºC durante 24 horas. Para el recuento de microorganismos se realizó una dilución seriada en base 10 en tampón fosfato (Merck, 15525) y siembra en medio sólido BGA (Brilliant Green Agar; Difco, 22850). Del recuento obtenido se diluyó el medio líquido hasta alcanzar una concentración de 108 UFC de Salmonella Enteritidis/ml. La solución del inóculo se preparó 24 horas antes de ser administrado a las gallinas, con un recuento de 8,5±0.15×107 UFC de Salmonella Enteritidis/ml. En el momento de la inoculación se realizó una comprobación del inóculo aplicado, con el resultado de 3.2±0.08×107 UFC Salmonella Enteritidis/ml.

 

5. Recogida de muestras

  • Heces frescas. Se recogió una muestra de 25 g de heces frescas por jaula, de la base de la jaula. Las muestras se analizaron colectivamente por cada grupo 2 semanas antes de la inoculación, 1 día después de la inoculación, y semanalmente después de la inoculación.
  • Huevo. Los huevos se recogieron diariamente. Se analizaron colectivamente por cada grupo 2 semanas antes de la inoculación, 1 día después de la inoculación, y semanalmente después de la inoculación.
  • Pienso. 25 gr de ambos piensos (con y sin el producto comercial) se analizaron previamente al inicio de la prueba.
  • Tejidos. Fueron sacrificadas aves a los 15 y 29 días post-infección. A los 15 días post-inoculación se sacrificaron 5 aves por grupo para comprobar la infección a nivel sistémico. Se recogió en cada ave muestras del ciego, ovarios, hígado y bazo. Las muestras de los animales de cada grupo se analizaron individualmente. A los 29 días post-inoculación, de nuevo 5 gallinas/grupo fueron sacrificadas. Los tejidos fueron analizadas en 2 pools por grupo: un pool de hígado+bazo+ovario y uno de ciegos. Sin embargo, en el grupo 4, los ciegos se analizaron individualmente.
  • Sangre. Se extrajo sangre a 5 aves por lote a las 17 y 19 semanas de vida (antes de la inoculación experimental), y antes del sacrificio a los 15 y 29 días post-inoculación. Se analizaron en busca de anticuerpos contra Salmonella utilizando un kit comercial ELISA.

 

 Resultados y discusiones

Las tablas 2, 3 y 4 muestran los resultados bacteriológicos de aislamiento e identificación de Salmonella Enteritidis en cada uno de los grupos. El análisis para detectar Salmonella antes del comienzo de la prueba en los piensos compuestos (Tabla 5) y gallinas (Tabla 2, muestras de sangre) fueron negativos. En pollitas de 17 semanas de edad, el análisis tuvo que ser llevado a cabo utilizando sólo 23 individuos debido al mal estado de 2 de las muestras de suero sanguíneo. Hubieron dos positivos en el grupo 3 y 1 positivo en el grupo 4 que se consideraron falsos positivos, porque los resultados de microbiología fueron negativos.

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Tabla 2. Aislamientos de Salmonella Enteritidis en heces, huevos, tejidos testados, y detección de anticuerpos en suero sanguíneo en los grupos 1, 2, 3 y 4(1)

El inóculo con 3,2×107 UFC de Salmonella Enteritidis por gallina produjo una infección sistémica e intestinal, con aislamientos en :

  • heces a partir del día 1 post-infección (ver Tabla 2)
  • tejidos internos y tractos reproductivos desde el día 15 post-infección (ver Tabla 2 y 3)
  • y huevos desde el día 4 post-infección (ver Tabla 2).

En una infección experimental con Salmonella Enteritidis y Salmonella Heidelberg llevada a cabo por Gast y col., encontraron colonización de vísceras y tracto reproductivo, en la que casi todas las muestras de heces fueron positivas para Salmonella a los 7 días, así como en el 83,3% de las muestras de hígado, 83,3% de bazos, y en el 66,7% de los ovarios. Aunque a los 21 días, el porcentaje de infecciones en heces se redujo en aproximadamente 50%; y en el caso del bazo oscilaron entre el 16,7 a 33,3%, en ovarios <16,7% y no se encontraron resultados positivos para Salmonella en hígados.

Teniendo esto en cuenta, los exámenes de vísceras en el estudio experimental con el producto aromático se llevaron a cabo de forma individual a los 15 días post-inoculación, para obtener una visión general de la distribución de la Salmonella en las gallinas de cada grupo, pero una vez que se comprobó que había infección sistémica en cada grupo, se llevaron a cabo análisis de pools de vísceras y ciegos para determinar la evolución de la infección.

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Tabla 3. Salmonella Enteritidis aislada en vísceras en los grupos 1, 2, 3 y 4(1)

La infección experimental por vía oral a pollitas ponedoras de 19 semanas de edad produjo una infección intestinal con eliminación y detección en heces a partir del día 1 post-inoculación, y de forma continua durante toda la duración de la prueba en los grupos 3 (infectados y no tratados) y 1 (infectados y tratados; ver Tabla 2). Se evidenció infección sistémica a los 15 días post-inoculación, detectándose Salmonella Enteritidis en hígado, bazo, ciego y serología en los grupos 3 (infectados y no tratados) y 1 (infectados y tratados; ver Tabla 3). A partir del día 29 post-inoculación, sólo se encontró Salmonella en ciegos del grupo 3 (infectados y no tratados; ver Tabla 3).

Las diferencias encontradas entre el grupo 1 (infectado y tratado) y el grupo 3 (infectado y no tratado) fueron que en el grupo 1 los resultados en hígado, bazo y ovario fueron positivos (infección sistémica) durante todo el periodo de ensayo mientras que en el grupo 3 los resultados fueron negativos a Salmonella a partir del día 29 post-inoculación (ver Tablas 2 y 3).

El tratamiento es aparentemente eficaz en el grupo 1, ya que probablemente éste impide la colonización del  ciego y la infección de las vísceras. A pesar de que los animales estaban en un ambiente contaminado, 29 días después de la inoculación, los resultados en el hígado, bazo, ovario fueron negativos.

Estos resultados están en línea con los datos presentes en la literatura que dan lugar a la conclusión de que el aceite esencial de clavo y el eugenol  tienen una actividad antimicrobiana in vitro frente a numerosas bacterias, principalmente patógenos entéricos (Escherichia coli y Salmonella) y con poco efecto en bacterias intestinales beneficiosas. El eugenol mostró actividad bactericida contra diferentes cepas de Salmonella.

En cuanto a los mecanismos antimicrobianos de los aceites esenciales, se ha descrito que sus constituyentes podrían conseguir la división de la bicapa lipídica de la membrana celular, lo que comportaría que fuera más permeable y conduciría a la pérdida de contenido citoplasmático de las células. El grupo hidroxilo del eugenol también parece unirse a las proteínas de membrana .

Esta actividad antimicrobiana puede conllevar el control de la colonización intestinal por Salmonella, al ser éste el punto de entrada de las infecciones sistémicas y del tracto reproductivo. Además, la Salmonella Enteritidis tiene la capacidad selectiva de colonizar los órganos reproductivos, y las diferentes partes de huevo (yema, albumen, membranas de la cáscara, o la cáscara en si) pueden directamente contaminarse en el ovario y el oviducto antes de la oviposición. La colonización del ovario o del oviducto de gallinas ponedoras puede ser producido por una infección sistémica por Salmonella Enteritidis, además de por inoculación oral, como se llevó a cabo en el presente trabajo. La contaminación de los huevos por Salmonella Enteritidis también puede ser causada por la penetración a través de la cáscara de los huevos de las heces contaminadas, después o durante la oviposición. De esta manera, antes de la oviposición, los huevos en formación están expuestos a infecciones que descienden de tejido ovárico colonizado, a infecciones ascendentes de los tejidos vaginales y cloacales colonizados, o infecciones laterales del tejido de la zona alta del oviducto. De este modo, la acción bactericida antes de la puesta y después de la puesta (evitando la contaminación con heces infectadas) puede desempeñar un papel importante en el control de la infección por Salmonella.

Las diferencias entre los grupos no infectados y tratados (grupo 2) y no infectados y no tratados (grupo 4) se apreció en el muestreo de los huevos.

Mientras que en el grupo 2 fue siempre negativo, el grupo 4 mostró resultados positivos a los 12 y 19 días post-inoculación. En el muestreo de heces, el grupo 4 obtuvo resultados positivos ya en el día 1 post-inoculación (ver Tabla 2).

El aceite esencial de E. caryophyllata incluido en el producto aromático puede haber impedido la contaminación cruzada en los huevos.

Los datos recopilados demuestran que el grupo no tratado (grupo 4) era susceptible a la infección ambiental, mientras que no hubo positivos en el grupo tratado (grupo 2), lo que puede ser debido a una mayor resistencia a la infección ambiental gracias al tratamiento con el producto aromático.

 

El objetivo más importante en el control de una infección sistémica es evitar la presencia de Salmonella en los huevos.

 

En el grupo 1 (inoculado y tratado), ésto se observó porque a partir de los 19 días post-infección ya no se obtuvo resultado positivo en huevos, a pesar de existir una contaminación ambiental. Lo mismo ocurrió a los 29 días post-inoculación con el pool de ciego y vísceras, que incluía también ovario (ver Tabla 2).

El efecto del producto aromático sobre la colonización intestinal, la eliminación fecal, la infección sistémica y la contaminación de los huevos parece ser efectiva en la eliminación de la infección intestinal y sistémica en el grupo que recibió el aceite esencial.

Los efectos positivos fueron detectables a los 29 días post-inoculación. Varios estudios internos aún no publicados, indican que la forma en que actúa la E. caryophyllata puede ser mediante la estimulación de la inmunidad celular (neutrófilos, macrófagos, CD8 y células CD4+), lo que favorecería procesos inflamatorios que evitarían la colonización del intestino por Salmonella.

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Tabla 4. Resultados serológicos por técnica ELISA(1)

También es importante señalar que en los resultados serológicos en los diferentes grupos, especialmente en el grupo 1, el nivel de seropositividad observado fue de casi el 100%, un hecho que indica contacto reciente con Salmonella, pero como los resultados de los cultivos bacteriológicos fueron negativos, se interpreta como una inmunidad residual post-infección. (ver Tabla 4)

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Tabla 5. Salmonella Enteritidis aislada e identificada en muestras ambientales

 

Conclusiones

 

  • El producto aromático que contiene un 20% de eugenol procedente del aceite esencial de clavo (Eugenia caryophyllata) añadido al pienso de gallinas ponedoras previene la contaminación cruzada en huevos.

  • El producto aromático no impidió la infección intestinal, pero es eficaz en la eliminación de las infecciones intestinales, impidiendo que devengan sistémicas.

 

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