Muestreo de micotoxinas y métodos de análisis utilizando LC-MS/MS

03/10/2019

Micotoxinas

Micotoxinas

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PATENT CO.

  • 1A Vlade Ćetkovića
    24211 Mišićevo - Severno-bački okrug - Serbia
  • 00 381 11 2414333
  • Web
Escrito por: Jog Raj*, Hunor Farkas, Zdenka Jakovcevic y Marko Vasiljevic
PATENT CO, DOO., Vlade Cetkovića 1A, 24 211, Misicevo, Serbia
Revista: Trimestre3 LATAM 2019

La alimentación animal puede estar contaminada con microorganismos, micotoxinas, subproductos animales, contaminantes orgánicos y metales tóxicos. Entre estos contaminantes, las micotoxinas se destacan como contaminantes alimentarios principales. Las micotoxinas se producen como metabolitos secundarios de diferentes hongos. Los principales hongos que producen micotoxinas son Aspergillus, Fusarium y Penicillium.

 

MUESTREO PARA EL ANÁLISIS DE MICOTOXINAS

Las micotoxinas más preocupantes, debido a su toxicidad e incidencia, son aflatoxina B1 (AFB1), deoxinivalenol (DON), ocratoxina (Ocra A), zearalenona (ZEA), fumonisina (FB1 i FB2) i T-2 toxinas.

Por lo tanto, el muestreo y el análisis de las micotoxinas son importantes para el control de rutina de la alimentación animal para determinar las micotoxinas.

El procedimiento de prueba de micotoxinas tiene varias etapas y generalmente consiste de tres pasos:

  • Muestreo
  • Preparación de muestras
  • Análisis (cuantificación)

El paso de muestreo determina el procedimiento sobre cómo muestrear y cuál debería ser el tamaño de la muestra. En las Figuras 1 y 2 se muestran algunas instrucciones de muestreo simplificadas.

Cuando se trata de materiales granulares, el paso de preparación de la muestra implica un proceso de dos componentes donde la muestra se muele en un molino para reducir el tamaño de partículas y luego se toma una muestra de la muestra básica para análisis y cuantificación de micotoxinas.

La concentración de micotoxinas medida en la muestra se usa para estimar la concentración real de micotoxinas en el lote base o para comparar un límite definido de aceptación / rechazo que generalmente es igual al límite legal prescrito.

La comparación de la concentración medida con el límite de aceptación / rechazo a menudo se denomina muestreo de aceptación porque el valor de concentración medida no es tan importante como si la concentración medida (y, por lo tanto, la concentración del lote) está por encima o por debajo del límite legal.

Las actividades de aseguramiento de la calidad y la investigación, la evaluación precisa y exacta de la verdadera concentración de micotoxinas es muy importante.

Figura 1.y 2 : Pasos para la toma de muestras de un camión y  toma de muestras de paletas

  • El muestreo debe ser monitoreado y se deben aplicar las técnicas apropiadas.
  • Los procedimientos de muestreo deben ser escritos, revisados y seguidos por todos los involucrados.

 

El gran error de muestreo en las pruebas de micotoxinas se debe a dos factores principales:

  • bajas concentraciones de micotoxinas en los productos
  • distribución desigual en el lote

Los resultados falsos negativos son muy comunes en las pruebas de micotoxinas, en gran parte debido al muestreo y la preparación de muestras inadecuados.

Cuando se toman muy pocas muestras individuales o la muestra total del lote es demasiado pequeña, es mucho más común «omitir» algunos de los granos / partículas contaminados. Este tipo de resultado, también es común cuando el conjunto de la sonda de muestra se divide o separa antes del proceso de molienda.

Métodos para probar materiales de alimentación animal en micotoxinas

En general, las pruebas de ingredientes de alimentos crudos para algunas de las principales micotoxinas se pueden realizar mediante pruebas rápidas in situ.

Para los alimentos combinados, una gama más amplia de análisis o el cumplimiento de los requisitos legales, el enfoque analítico es el más apropiado. En algunos casos, las pruebas rápidas pueden dar resultados no concluyentes, aunque los síntomas de la ingesta de micotoxinas en animales aún pueden ser notables.

Si este es el caso, se recomienda realizar más pruebas utilizando métodos avanzados de LC-MS / MS para dar una imagen más clara de una gama más amplia de posibles culpables, por ejemplo micotoxinas enmascaradas que son indetectables por métodos convencionales o micotoxinas nuevas que son más difíciles de entender y aún no están reguladas.

 

ELISA

ELISA (pruebas de enzimas inmunosorbentes) kits de prueba son precisos y confiables.

Estos kits de prueba son la solución ideal para medir múltiples muestras en paralelo con un tiempo de incubación de 15 minutos para hasta 42 muestras.

  • Las principales ventajas de los kits de prueba ELISA son que son rápidos, baratos y buenos para obtener la primera evaluación.
  • Algunas desventajas incluyen que solo se pueden detectar materias primas y micotoxinas principales.
  • Otra desventaja es mantener la rentabilidad, ya que requiere al menos 30 muestras analizadas por ELISA kit.

HPLC

Este método se basa en bombas que hacen circular una solución líquida bajo presión que contiene una mezcla de muestra a través de una columna llena de material de adsorbente sólido.

Diferentes componentes en la muestra, por ejemplo las micotoxinas, interactúan de varias maneras con el material adsorbente, y cruzan la columna a diferentes velocidades y permiten la separación mientras que fluyen fuera de la columna. Posteriormente, el detector cuantifica las micotoxinas comparando su señal con la de los estándares seleccionados.

Hay varios detectores disponibles, como:

  • detectores espectrofotométricos (UV-VIS, conjunto de diodos)
  • refractómetros (RI)
  • detectores de fluorescencia (FLD)
  • espectrómetros de masas (MS)
  • Las principales ventajas de la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) son su alta sensibilidad, ya que solo se requieren pequeñas cantidades de muestras, que es aplicable a matrices complejas, confiable y muy precisa.
  • Las desventajas incluyen que estas pruebas son exigentes y caras; los compuestos deben tener propiedades de absorción de UV o fluorescencia, y se requieren técnicos altamente calificados para realizar el análisis.

 

LC-MS/MS

Esta técnica combina las propiedades físicas de la separación por HPLC con capacidades de análisis de masas con espectrómetro de masas (MS).

Los dos métodos analíticos actúan sinérgicamente. La cromatografía separa las mezclas con múltiples componentes (por ejemplo, micotoxinas) antes de que el espectrómetro de masas proporcione las características estructurales de los componentes individuales con alta sensibilidad y especificidad.

Las variaciones más comunes del proceso son la cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas (LC-MS) o la espectrometría de masas en tándem (LC-MS / MS).

 

Desarrollo de métodos de multi-micotoxinas basadas en LC-MS / MS

Dado que es necesario analizar la contaminación de micotoxinas en el alimento para animales, en PATENT CO se usa un método rápido y simple basado en LC-MS / MS para determinar y cuantificar todas las micotoxinas (aflatoxina B1, B2, G1, G2, deoxinivalenol, zeralenona, fumonisina B1 y B2, T-2, HT-2, ocratoxina A) regulados en alimentos (Directivas de la UE 2002/32 / CE, 2006/576 / CE y 2013/165 / UE).

El método basado el principio de «dilución y agrietamiento». Este método incluye la extracción en dos pasos y la centrifugación de los extractos.

Para compensar los efectos de la matriz en la ionización por electropulverización, los extractos se mezclan con estándares internos etiquetados como [13C] para cada grupo de micotoxinas (13C AB1, 13C DON, 13C ZON, 13C OTA, 13C FB1 y 13C T-2) antes de la inyección en LC – MS / S.

El método ha sido validado con éxito en maíz, forraje, trigo, cebada, harina de soja, salvado de trigo, harina de girasol y TMR.

Los parámetros de rendimiento del método se obtuvieron mediante validación interna. Se aplicaron muestras en blanco con una mezcla de 11 micotoxinas estándar en dos niveles (LOQ y 10xLOQ) en 12 réplicas.

El RSDr (Desviación Estándar Relativa de Repetibilidad) de este método está entre 2.5% y 13.4%, y las recuperaciones aparentes estuvieron entre 62% y 115% para todos los análisis.

Se concluye que el método de “dilución y agrietamiento”, con la adición de un estándar interno etiquetado con 13C, es capaz de determinar todas las micotoxinas reguladas por la UE en la alimentación animal y la forraje.

Figura 3.: Diagrama de flujo del análisis de micotoxinas usando LC-MS / MS5,00g muestra homogeneizada

Los resultados se expresan en µg/kg o ppb en relación con los alimentos con un contenido de humedad del 12%

 

Conclusiones

Las micotoxinas se han convertido en una amenaza regular para la producción de alimentos animales y para los granjeros, porque afectan a la salud general de los animales. Por lo tanto, es necesario verificar regularmente las materias primas y los productos de alimentación animal para determinar las micotoxinas utilizando métodos de muestreo y análisis adecuados.



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